Krok 0 — Procedura wstępna
Zanim przejdziesz do analizy bioinformatycznej, musisz uzyskać wyniki badań laboratoryjnych: sekwencjonowanie DNA guza (WES) i typowanie HLA pacjenta. Poniżej znajdują się instrukcje krok po kroku.
1. Biopsja guza
Onkolog pobiera próbkę tkanki nowotworowej (biopsja igłowa, chirurgiczna lub płynna biopsja krwi — ctDNA). Jednocześnie pobierana jest próba krwi obwodowej jako referencja DNA zdrowego.
- Biopsja tkankowa: min. 10 mg tkanki
- Biopsja płynna: 10 ml krwi (probówka EDTA)
- Referencyjna krew: 5 ml (probówka EDTA)
2. Sekwencjonowanie WES
Whole Exome Sequencing (WES) — sekwencjonowanie wszystkich regionów kodujących DNA (egzom ~1,5% genomu). Porównanie DNA guza vs DNA zdrowego ujawnia mutacje somatyczne.
- Wynik: plik VCF (Variant Call Format)
- Czas realizacji: 5–15 dni roboczych
- Pokrycie: min. 100× tumor, 30× normal
3. Typowanie HLA
Określenie alleli HLA klasy I pacjenta (A, B, C). Każdy człowiek ma unikalną kombinację 6 alleli HLA (2× A, 2× B, 2× C), które decydują, jakie peptydy będą prezentowane układowi odpornościowemu.
- Metoda: NGS (Next-Generation Sequencing)
- Rozdzielczość: 4-cyfrowa (np. A*02:01)
- Czas realizacji: 3–7 dni roboczych
4. Analiza RNA-seq (opcjonalnie)
Sekwencjonowanie RNA guza pozwala określić, które zmutowane geny są faktycznie aktywne (ekspresja). Znacząco poprawia jakość predykcji — eliminuje mutacje w nieaktywnych genach.
- Wynik: dane ekspresji genów (TPM)
- Czas: 7–14 dni roboczych
- Materiał: zamrożona tkanka w RNA-later
Poniższe laboratoria oferują pakiety diagnostyczne kompatybilne z naszym pipeline. Wynik w formacie VCF można bezpośrednio załadować do narzędzia.
Polska – Rozwijające się Ośrodki NGS
MedGen Centrum Medyczne (Warszawa) TAT: ~kilkanaście dni
Profilowanie: WES w zaawansowanych panelach NGS, pełne, zoptymalizowane pod immunologię typowanie układu HLA. Możliwość adaptacji WES dla krwi obwodowych w celach porównawczych.
Kontakt: diagnostyka@medgen.pl | +48 506 069 568 / 512 40 90 90
Strona WWW: medgen.pl/ngs
Genomed S.A. (Warszawa) TAT: Zależnie od zlecenia (min. kilkanaście dni)
Profilowanie: Wysokoprzepustowe platformy sekwencjonowania całogenomowego i egzomowego (WES/WGS). Zautomatyzowane rurociągi do genotypowania układów HLA. Pliki wyjściowe i eksport danych z sekwentatorów bezpośrednio do klienta.
Kontakt: diagnostyka@genomed.pl | +48 22 498 2 498
Strona WWW: diagnostyka.genomed.pl
Warsaw Genomics S.A. (Warszawa) TAT: ~2-4 tygodnie
Profilowanie: Ustrukturyzowane panele celowane i rozszerzone testy z nowotworów tkanek litych (FFPE). Walidacja obciążeń immunogennych (TMB), niestabilności mikrosatelitarnej (MSI) oraz wariantów onkogennych z obszarów WES.
Kontakt: info@warsawgenomics.pl
Strona WWW: warsawgenomics.pl
Instytut Genetyki Człowieka PAN (Poznań) TAT: Harmonogram badawczy
Profilowanie: Rygorystyczne profilowanie NGS dla guzów litych i izolacji DNA. Prowadzony WES z genotypowaniem patologii. Innowacyjne usługi oceny transkryptomu (RNA-seq) oraz unikalne profilowanie pojedynczych komórek (sc-RNAseq za pomocą technologii 10x Genomics).
Strona WWW: icm.igcz.poznan.pl
Europa – Certyfikowane Instytuty Integracyjne
CeGaT GmbH (Tübingen, Niemcy) TAT: ~15 dni (rutynowo), do 4 tyg. (pełny)
Profilowanie: Pionier z potężnym testem CancerNeo® przeznaczonym wybitnie pod szczepionki. Pokrycie ultra głębokie (ExomeXtra >100x WES guz vs norma). Usługa integruje w pełni rygorystyczny RNA-seq komparatystyczny z genotypowaniem wysokiej rozdzielczości klas HLA-I / II. Błyskawiczna logistyka wewnątrzeuropejska z twardymi raportami (dane RAW i dokumenty medyczne).
Kontakt: tumor@cegat.com
Strona WWW: cegat.com/CancerNeo
OncoDNA S.A. (Gosselies, Belgia) TAT: ~2-3 tygodnie
Profilowanie: Flagowa, zwalidowana standardem CE-IVD platforma OncoDEEP integrująca dogłębne analizy dla nowotworów (guzy lite FFPE oraz biopsje płynne cfDNA z krwi). Unikalne potoki hybrydowe do generowania profilu WES/CGP przy jednoczesnym rozróżnianiu wariantów fuzji genowych systemami transkryptomiki obszernych RNA-seq z ewaluacją mikrośrodowiska (TME).
Kontakt: scientificsupport@oncodna.com | +32 (0) 71 18 35 00
Strona WWW: oncodna.com/clinical
Reprocell (Globalna sieć / EU) TAT: ~30 dni (możliwy CITO)
Profilowanie: Platforma NeoSight ukierunkowana absolutnie stricte na rurociągi neoantygenowe. In-house algorytmy predykcyjne badają obfitość transkryptów z WES vs krew na głębokim potoku selekcji filtru translacyjnego połączonego nierozerwalnie z 4-cyfrową rozdzielczością zgodności tkankowej pacjenta (HLA klas), izolując tylko wysoce prawdopodobne cele CD8+.
Strona WWW: reprocell.com/neoantigen-detection
Świat / Północna Ameryka – Liderzy Czasowej Przepustowości i Badań HLA-LOH
Personalis, Inc. (Kalifornia, USA) TAT: ~14 dni
Profilowanie: Platforma złoty standard (NeXT Dx, ImmunoID NeXT). Nienegocjowalny rygor i siła sprzęgnięta na WES (nierzadko 300x i ekstrakcje do 1000x u ucieczki) połączonego obfitą i wewnątrzplatformową macierzą w pełni odizolowanych markerów RNA-seq. Centrala używa genialnego zwalidowanego układu wprost z rejonów DASH do bezwzględnych poszukiwań delecyjnych i ucieczkowych utrat na poziomie locus chromosomowego utraty genetycznych zdolności prezencyjnych mutanta nowotworowego na bazie zjawiska komórkowego LOH u pacjentów (HLA-LOH).
Kontakt: clientservices@personalis.com | +1 (855) 373-7978
Strona WWW: personalis.com/next-dx
BostonGene (Massachusetts, USA) TAT: <9 dni (Mediana 8 dni)
Profilowanie: Tumor Portrait™ Test z wykorzystaniem zintegrowanych systemów wspieranych własnym AI. Test dysponujący potężną wydolnością badawczą operując na połączonym profilowaniu WES na tkankach od pacjentów oraz głębokim (na miliony odczytów próg aktywacji) systemie RNA WTS do modelowania i kategoryzowania odrębnego architektonicznego zjawiska TME u pacjenta oraz klasycznych przewidywań u wariacji środowiska tkankowego u HLA (z LOH) do badań szczepionek eksperymentalnych.
Kontakt: clientservices@bostongene.com
Strona WWW: bostongene.com
Tempus (Illinois, USA) TAT: <7 dni (Tryb ratunkowy)
Profilowanie: Najszybsza organizacja pod kątem rygoru z testem Tempus xT wykorzystująca zautomatyzowane fermy na systemie Illunima NovaSeq dla ujęć testów WES (na zintegrowanej ścieżce komparatystyki biopsji litej z systemami tła cfDNA / krew) wzbogaconego rygorem analiz na fuzje w sekwencjonowaniu wejściowym dla materiałów zaangażowanych po zautomatyzowanym odczycie z ekstrakcji RNA-seq. Standard z badaniami utrat zdolności receptora (LOH) w oparciu o terminalne szybkie procedury.
Kontakt: 800.739.4137 | Faks logistyczny: 800.893.0276
Strona WWW: tempus.com
Caris Life Sciences (Arizona, USA) TAT: Tygodniowe szacunki ujęciowe
Profilowanie: Potężne powielenie i oszczędności mikroskopijnego wycinka komórkowego FFPE stosując badanie MI Tumor Seek Hybrid™ polegające na genialnej reakcji u wyizolowanego materiału bez jednoczesnego zjawiska rozdzielnej procedury odzyskiwania WES rzędu potężnych \~23 000 kodujących fragmentatycznych odczytów dla egzomu ściśle na jednolitym badaniu dla transkryptów w analizie RNA-seq pod obciążenia fuzji onkogenów z zachowaną oceną u parametrów stabilności MSI i rozdzieleniach zdolności mutowania dla genotypów tkanek obciążonych statusami genetyki klasycznej we framugach od zjawisk u LOH przy ocenie rejonów LDT w onkologii amerykańskiej.
Kontakt: 1.888.979.8669
Strona WWW: carislifesciences.com
VCF to międzynarodowy standard opisu wariantów genetycznych, utrzymywany przez Global Alliance for Genomics and Health (GA4GH). Plik zawiera:
- Chromosom i pozycja — dokładna lokalizacja mutacji w genomie
- REF / ALT — allel referencyjny (zdrowy) i alternatywny (zmutowany)
- QUAL — jakość detekcji mutacji (im wyższa, tym pewniejsza)
- INFO — dodatkowe dane: gen, zmiana aminokwasu, VAF, ekspresja
Plik VCF otrzymujesz bezpośrednio od laboratorium sekwencjonującego lub z pipeline bioinformatycznego (Mutect2, Strelka2, VarScan2).
Wypełnij dane pacjenta i lekarza prowadzącego. System wygeneruje kompletną dokumentację: wniosek do Komisji Bioetycznej, formularz świadomej zgody, wniosek do URPL (Art. 4 Prawa farmaceutycznego) oraz checklist regulacyjny — ze wszystkimi wymaganymi podstawami prawnymi (Konstytucja RP, Ustawa o zawodach lekarza, Prawo farmaceutyczne, Deklaracja Helsińska, Konwencja z Oviedo, rozporządzenia UE).
Uwaga: Dokumenty automatycznie uwzględnią wyniki pipeline (mutacje, neoantygeny, konstrukt mRNA), jeśli zostaną wygenerowane po ukończeniu analizy.
Komisji Bioetycznej
świadomej zgody
(Art. 4)
regulacyjny
Krok 1 — Wgrywanie danych mutacji somatycznych
Załaduj plik VCF z wynikami sekwencjonowania WES. Pipeline automatycznie wyodrębni mutacje somatyczne i wygeneruje peptydy kandydatów (8–11 aminokwasów).
Plik VCF powinien zawierać mutacje somatyczne (guz vs. zdrowa tkanka). Jeżeli nie posiadasz pliku VCF — użyj danych demonstracyjnych poniżej, aby przetestować pipeline z przykładowymi mutacjami w genach BRAF, KRAS, TP53, EGFR i innych.
Krok 2 — Predykcja wiązania peptyd–MHC klasy I
Algorytm NetMHCpan 4.1 (IEDB/NIH) oblicza, które zmutowane peptydy zostaną zaprezentowane na powierzchni komórek przez cząsteczki HLA pacjenta.
Platforma generuje plik CSV z peptydami i allelami HLA wgrywasz go do darmowego notebooka Google Colab notebook wywołuje IEDB API (NetMHCpan 4.1) pobierasz wyniki CSV wgrywasz je tutaj.
Dlaczego Colab? IEDB API wymaga publicznego IP (nasz serwer jest zablokowany). Google Colab ma dostęp do API i wystarczającą moc obliczeniową. Algorytm NetMHCpan 4.1 opracowany przez DTU Health Tech (Dania) jest standardem w immunoinformatyce — stosowanym m.in. w badaniach klinicznych firm takich jak BioNTech i Moderna.
Zaznacz allele HLA pacjenta poniżej, a następnie kliknij „Eksportuj dane". System wygeneruje plik CSV ze wszystkimi kombinacjami peptyd × allel.
a) Otwórz Google Colab i kliknij File → Upload notebook → wgraj pobrany plik
.ipynb.b) Kliknij Runtime → Run all (lub
Ctrl+F9).c) W Kroku 1 notebooka wgraj plik
binding_input.csv (pobrany powyżej).d) Poczekaj na zakończenie predykcji (~3–10 min w zależności od liczby peptydów).
e) Na końcu notebook automatycznie pobierze plik
binding_results.csv z wynikami.
Krok 3 — Ranking neoantygenów
Algorytm wielokryterialny (wiązanie, ekspresja, VAF, obcość BLOSUM62, długość) ocenia każdy peptyd na skali 0–100. Najwyżej ocenione neoantygeny to cele szczepionki.
Score 0–100 jest obliczany z kilku czynników: siła wiązania HLA (0–30 pkt), ekspresja genu w guzie (0–25), częstotliwość allelu VAF (0–15), obcość peptydu vs normalnego białka (0–20, macierz BLOSUM62), długość peptydu (0–10, optymalna: 9-mer).
Krok 4 — Optymalizacja kodonów mRNA
Translacja sekwencji aminokwasowej na zoptymalizowaną sekwencję mRNA z użyciem preferencji kodonowych komórek ludzkich (Kazusa DB). Wysoki CAI = szybsza produkcja białka.
CAI (Codon Adaptation Index) — miara dopasowania do preferencji kodonowych człowieka. Wartość 1.0 = idealne. GC% 40–60% = optymalna stabilność mRNA.
Krok 5 — Projektowanie konstruktu mRNA
Składanie kompletnej cząsteczki mRNA szczepionkowej. Architektura: Cap-1 5'UTR peptyd sygnałowy [epitopy z linkerami] STOP 3'UTR Poly(A) (120 nt; optymalnie 100–150 nt, Trepotec et al., Mol Ther 2019).
Krok 6 — Eksport wyników
Pobranie wyników w standardowych formatach kompatybilnych z laboratoriami syntezy mRNA i dokumentacją kliniczną.
Zaawansowany PDF łączący wszystkie wyniki w urzędowy wniosek gotowy do podpisu. Podaj inicjały pacjenta oraz dane lekarza do auto-wypełnienia metryczki.
FASTA — sekwencja mRNA do syntezy (prześlij do GenScript, RiboPro, Eurofins). CSV — tabela danych do Excela. JSON — raport maszynowy. TXT — raport do dokumentacji laboratoryjnej / Komisji Bioetycznej.
Gotowy plik FASTA (oraz opcjonalnie struktury 3D) stanowi wejściowy dokument (Research Grade lub docelowo GMP) dla specjalistycznych firm CDMO. Znajdź partnera logistycznego poniżej:
Polska – Hub Biotechnologiczny (Priorytet Logistyczny)
SyVento BioTech (Skawina) Research Grade & GMP
Kompetencje: Pionier z certyfikacją do niezależnej produkcji i testów. Zaawansowana synteza API o zróżnicowanych standardach z wybitną zdolnością formulacji do nanocząstek lipidowych (LNP). Możliwość mikroskali dla ujęć spersonalizowanych onkologicznie.
Kontakt: office@syvento.com | +48 885 855 564
Strona WWW: syvento.com
Mabion S.A. (Konstantynów Łódzki) GMP (Fill & Finish)
Kompetencje: Gigant giełdowy przechodzący udaną transformację w nowoczesne CDMO. W strategicznym i zintegrowanym partnerstwie z SyVento, Mabion zapewnia doskonałe wsparcie rozlewu (aseptyczne Fill & Finish) docelowych napełnień w fiolkach pod ścisłymi regulacjami cGMP.
Kontakt: bd@mabion.eu | +48 42 207 78 90
Strona WWW: mabion.eu
Celon Pharma S.A. (Łomianki / Kazuń Nowy) Research Grade & GMP
Kompetencje: Realizator programu "TransformRNA". Posiadają ustrukturyzowane linie badawczo-rozwojowe (poziom in vivo proof-of-concept) oraz bezszwową, specjalistycznie skonstruowaną przestrzeń produkcyjną dla leków z RNA. Doświadczenie w rygorstycznie optymalizowanych matrycach.
Kontakt: info@celonpharma.com | +48 22 751 59 33
Rezon Bio (Gdańsk) / ExploRNA (Warszawa) Spin-offs & GMP CDMO
Rezon Bio: Demerger Polpharmy dysponujący masowym zapleczem biologicznego skalowania i obsługi dużych CDMO z certyfikacjami zachodniego typu.
ExploRNA: Wyspecjalizowany producent kapujący (AvantCap® ograniczający tworzenie toksycznego dsRNA) współpracujący z Primrose Bio w celu optymalizacji chemiczno-kinetycznej na wczesnych i późnych seriach optymalizacyjnych dla rygorystycznych zamówień bioinformatycznych.
Europa – Regulowany Rynek Farmaceutyczny (EMA)
Patheon (Thermo Fisher) (Monza, Włochy) GMP / Clinical Grade
Kompetencje: Potężny, niesamowicie elastyczny sprzętowo kampus z certyfikacjami. Oferuje od jedno-gramowych wyprodukowanych aseptycznie serii LNP na stany rzadkie/neoantygenowe po wielokilogramowe uboje populacyjne. W 100% zintegrowany in-house IVT do Fill/Finish (cold chain).
Kontakt: +39 039 2047 1 | patheon.com
AGC Biologics / BioSpring / Rentschler Research Grade & cGMP
Niemcy / Austria / Belgia: Wielkie uznanie logistyczne wokół hubów pod Frankfurtem czy w Heidelbergu. (AGC zapewniał matryce m.in dla BioNTech). Skala, bezpieczeństwo, potężne procedury zatwierdzania i ugruntowana na świecie rygorystyczna zgodność w zakresie analityki (HPLC/CGE) w standardzie ICH Q7 i przepisów certyfikacyjnych EMA.
Świat – Innowacje i Skalowalność (USA / Azja)
TriLink / Aldevron / GenScript (USA) Research & GMP Pionierzy
Kompetencje: Hub wiodących patentów kapujących (CleanCap® w TriLink, obniżający immunogenność Codex® HiCap T7 w Aldevron, a także wirtualne darmowe kombajny optymalizacyjne Codonu GenSmart w GenScript). Bezprecedensowo pomagają na etapach badawczo-rozwojowych (Proof of Concept).
Samsung Biologics (Korea Pd) / Azja Pacific Gigaskala inżynieryjna GMP
Kompetencje: Zapewniają ekstremalną dyspozycyjność pojedynczych rygorystycznych serii jednorazowych reaktorów o obłędnej w medycynie pojemności od skali ławkowej 0.1 L do masowych 200 L masowych systemów transkrypcyjnych i nawigują sprawnie z innością obiekty w Chinach (WuXi, Kudo).